Cahier des charges qPCR

Service proposé à la demande

1 - Discussion préalable avec l’utilisateur

Présentation du projet, du type d’expérience recherché : analyse comparative des niveaux d’expressions de gènes entre différents génotypes, ou conditions de culture, etc...

2 - Délai de retour des résultats

En fonction de la disponibilité du responsable (à hauteur de 20%) et de la disponibilité de l’appareil.

3- Matériel de départ

ARN : 1ug d'ARN totaux dans 10uL d'eau.
Idéalement, les ARN totaux auront été préalablement traités à la DNaseI pendant l'extraction en utilisant le kit NEB Monarch Total RNA Miniprep.
Par défaut, synthèse d'ADNc en combinant oligodT et random priming. Sinon, il faudra préciser ses préférences (amorce spécifique, seulement oligodT ou random priming, etc..)

4- Choix et validation expérimentale des amorces et de l’amplicon, contrôle qualité des ADNc

4.a- Le design se fera par l'utilisateur (voir par exemple ce site ). Celles-ci seront fournies à une concentration de 10µM.
4.b- Le calcul de l'efficacité des amorces se fera par obtention de la pente d'une gamme de dilution utilisant
-soit le matériel de référence standardisé (ADNc WT aux dilutions 1:1, 1:10, 1:100),
-soit le matériel de départ fourni par l'utilisateur (ARN totaux convertis en ADNc, dilutions 1:1, 1:10, 1:100).
L'efficacité des amorces sera comparée à celle des amorces du contrôle interne (gènes de ménage, voir partie 5). La spécificité des amorces et la qualité de l’amplicon seront systématiquement validés par analyse de type melting curve.
4.c- Le contrôle qualité des ARN totaux fournis (absence de contamination à l'ADNg) se fera en utilisant les échantillons contrôles 'NO RT' et les amorces du gène de ménage ACTIN7.

5- Choix du gène de référence (gènes de ménage)

Le service dispose de plusieurs gènes de ménages validés par ses soins et mis à disposition des utilisateurs (ACTIN7, RHIP1, UBIQUITIN10).
Le choix du/des gène-s de ménage se fera lors de la discussion préalable avec l’utilisateur.

6- Analyse des résultats

6.a- Récupération des données brutes (Ct values)
6.b- Contrôle qualité des données: analyse des coubres de fusion (melting curve), vérification des courbes de q-PCR, validation/correction des seuils de coupure définies automatiquement par le logiciel.
6.c- Analyse des résultats selon la méthode ΔΔCt si besoin.

Note

- ACTIN7 primers amplify from gDNA and cDNA
- RHIP1 primers amplify from cDNA only