Cahier des charges Sanger

Prestataire de service

Eurofins / Services GATC / Allemagne - Envoi par UPS

Prestations proposées

Séquençage de plasmides entiers ou de produits PCR et fragments plasmidiques

Fonctionnement du service

Les expéditions sont programmées en fonction des demandes et de l'urgence des résultats.
Aucune limitation dans l'envoi de séquences. Pour un nombre élevé, prévoir une plaque de séquençage (des plaques de 48 et 96 séquences sont disponibles) et non des tubes.
Les étiquettes d'expédition sont à retirer au bureau de Michèle.

Préparation des échantillons

Pour les plasmides entiers 
Pour chaque réaction de séquence, prévoir :

• Regular (2,5 - 25 kbp) : 30 ng/ul - Minimum 20 ul de volume
• Large (25 - 125 kbp) : 50 ng/ul - Minimum 30 ul de volume
• XL (125 - 300 kbp) : 50 ng/ul - Minimum 50 ul de volume 

Veuillez envoyer vos tubes d'échantillons conformément aux exigences ci-dessous :

• Utilisez des tubes safe-lock de 1,5 ml pour vos échantillons
• Veuillez fournir vos échantillons soit dans de l'eau nuclease-free, soit dans un tampon d'élution (Tris 10 mM, pH 8,5)
• N'utilisez pas de Nanodrop pour vos mesures de concentration. Les techniques spectrophotométriques ne sont pas fiables pour la mesure de la quantification. Veuillez utiliser une méthode fluormétrique, comme le Qubit.
• Ne pas coller ou envelopper les tubes avec du parafilm. Les tubes Safe-lock offrent une étanchéité parfaite et une protection contre l'évaporation

Pour les produits PCR et fragments plasmidiques
Pour chaque réaction de séquence, prévoir :

• ADN plasmidique: 50 à 100 ng/uL
• Produits PCR
  • 150-300 pb : 5 ng
  • 300-1000 pb : 25 ng
  • 1000-3000 pb : 50 ng
• Ajouter 2,5 µl d'amorce d’une concentration de 10 µM soit 10 pmoles/µl
• Compléter le volume à 10 µl avec de l’eau dans des tubes Eppendorf de 1,5 ml
• Coller l’étiquette d’envoi comme sur la photo à la fin du document

Les amorces de séquençage

• Les amorces ne doivent pas contenir de phosphorylation ou de colorants fluorescents
• La longueur d'amorce optimale se situe entre 16 et 25 bases
• La température de fusion (Tm) doit être comprise entre 50 et 62°C
• La teneur en GC de l'amorce doit être de 35 à 60 %
• Idéalement, un G ou C doit être situé à l'extrémité 3' de l'amorce
• Le nombre de G ou C en 3’ ne doit pas dépasser 2 G ou C
• Si possible, évitez > 3 bases identiques d'affilée dans la séquence

Récupération des résultats

Les résultats des séquences sont accessibles sur le NAS interne du laboratoire. Un email vous sera envoyé pour vous informer de la disponibilité.

Important

Pour le séquençage des fragments PCR, un dosage sur gel est recommandé.
La qualité de la séquence dépend en grande partie de la pureté et du dosage de l'ADN.

Pour toute information supplémentaire, n'hésitez pas à contacter Michèle.